Small RNA测序及分析

MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。目前研究microRNA的方法主要是通过实时定量PCR以及基因芯片技术，这些方法主要关注microRNA 的表达与定量，并仅局限于研究那些序列信息或二级茎环结构信息已知的microRNA，无法寻找和发现新的microRNA 分子。基于Illumina高通量测序平台的microRNA 测序技术突破了目前研究技术手段上的局限性，使研究人员能够直接对样本中指定大小的所有microRNA分子进行高通量测序，在无需任何序列信息的前提下研究microRNA的表达谱并在此基础上发现和鉴定新的microRNA分子，并提供了更加灵活和深入的研究分析方法。

一、技术路线

二、数据分析

1.      序列去杂（去除接头序列、简单序列等）

2.      Rfam数据库以及Genbank数据库比对，去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的降解片段

3.      鉴定mRNA的降解片段

4.      同miRNA数据库比对，鉴定miRNA

5.      同参考基因组比对，预测新的miRNA

6.      分析两个样品miRNA的表达差异

7.      miRNA表达模式聚类分析

8.      预测miRNA靶基因

三、实验周期

由于合作伙伴的个性化需求不同，实验的周期也各不相同。从获得合作伙伴样品、高通量测序到数据分析，一般控制在30到40工作日内完成。

四、常见问题解答

 1. 进行小RNA测序对于组织样品提取总RNA有什么特殊要求？

答：如果要进行小RNA测序，提取总RNA时建议不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒，也不要使用LiCl沉淀，以免损失小片段RNA。除此之外也可以使用专用小RNA提取试剂盒来进行提取。 

2．Small RNA分析需要合作伙伴提供参考序列吗？

答：需要，最好提供合作伙伴所做物种的全基因组序列，如果没有，也可以提供近缘物种的全基因组序列或者是本物种的EST等序列作为参考序列，另外还需要老师提供相关的exon/ intron, repeat信息以及基因编码序列。